Przełom w syntezie peptydów fazy stałej

Przemysłowa innowacja w kierunku syntezy peptydów bez TFA

Synteza peptydów na fazie stałej (SPPS) od dawna polega na użyciu kwasu trifluorooctowego (TFA) jako standardowego odczynnika do globalnej deprotekcji łańcuchów bocznych i rozszczepienia żywicy, ze względu na jego wysoką wydajność w łamaniu powiązań grup chroniących.

Jednak rosnące obawy dotyczące wpływu na środowisko, stabilności chemicznej i ograniczeń procesowych przyspieszyły poszukiwania alternatywnych strategii.

TFA jest klasyfikowany jako trwała substancja chemiczna i coraz częściej wiąże się z presją regulacyjną, w tym proponowanymi ograniczeniami UE dotyczącymi substancji per- i polifluoroalkilowych (PFAS), które w przyszłych ramach mogą obejmować TFA.

Główne ograniczenia SPPS opartej na TFA obejmują:

• Obciążenie nieodzyskiwalnymi rozpuszczalnikami i obawy dotyczące zrównoważonego rozwoju środowiskowego
• Zależność od grup chroniących wrażliwych na kwas
• Problemy z agregacją spowodowane hydrofobowymi grupami chroniącymi (np. tBu, Boc, Trt)
• Degradację wrażliwych sekwencji, takich jak peptydy N-metyloowane, w silnie kwasowych warunkach
• Przedłużone wymagania deprotekcji dla grup takich jak Pbf-Arg, zwiększające ryzyko rozszczepienia szkieletu peptydowego

Te wyzwania spowodowały rozwój nowej generacji ortogonalnych strategii grup chroniących do syntezy peptydów w łagodniejszych i bardziej zrównoważonych warunkach.

Nowa platforma SPPS fotokatalityczna Fmoc/Pic

Ostatnie badanie opublikowane przez grupę profesora Ping Wanga z Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju (JACS) wprowadza nową strategię grup chroniących Fmoc/Pic (pirydylometyl), która umożliwia:

• Ortogonalną ochronę łańcuchów bocznych
• Deprotekcję napędzaną światłem widzialnym poprzez fotokatalityczne rozszczepienie wiązań C–heteroatomowych
• Globalną deprotekcję bez kwasu
• Pełną kompatybilność z automatycznymi syntezatorami peptydów

Ten system zastępuje tradycyjną chemię wrażliwą na kwas platformą fotoredoksową katalityczną, oferując zrównoważoną alternatywę dla syntezy peptydów opartej na TFA.

Fotokatalityczna deprotekcja poprzez chemię światła widzialnego

Metoda polega na katalizie fotoredoksowej w celu efektywnego rozszczepienia wiązań C–heteroatomowych w grupach chroniących łańcuchy boczne aminokwasów.

Używając seryny chronionej Fmoc/Pic jako substratu modelowego, zidentyfikowano zoptymalizowane warunki:

• Źródło światła: kompaktowa lampa fluorescencyjna (CFL) o mocy 10 W
• Katalizator: Ru(bpy)₃Cl₂ (1,5 mol%)
• Agent redukujący: kwas askorbinowy (5,0 ekw.)
• System rozpuszczalników: PBS/MeOH (pH 5,0)

W tych warunkach pełna deprotekcja została osiągnięta w ciągu 20 minut z kwantytatywną konwersją.

Główne wnioski mechanistyczne obejmują:

• Optymalna reaktywność obserwowana przy pH 4,0–5,0, co wskazuje na znaczenie protonacji pirydyny
• Promieniowanie LED niebieskie lub zielone zmniejszyło wydajność z powodu nieoptymalnego dopasowania absorpcji do Ru(bpy)₃²⁺
• Alternatywne fotokatalizatory, takie jak Eozyna Y, wykazały niewystarczający potencjał redoksowy
• Organiczny fotokatalizator 4-CzIPN demonstrował porównywalną wydajność, potwierdzając możliwość realizacji bez metali

Eksperymenty kontrolne potwierdziły, że światło, fotokatalizator i reduktor są niezbędne do transformacji.

Szeroki zakres aminokwasów i kompatybilność z grupami funkcyjnymi

Platforma Fmoc/Pic została pomyślnie rozszerzona na szeroką gamę aminokwasów z dostosowanymi projektami grup chroniących:

• Kwas asparaginowy i kwas glutaminowy: Ochrona Dmpic zapobiega cyklizacji i tworzeniu piroglutaminianu
• Arginina, lizyna, tryptofan, histydyna: Zmodyfikowane pochodne Pic redukują niepożądane reakcje boczne
• Kompatybilność z aminokwasami fosforowanymi i nie-naturalnymi aminokwasami

Co ważne, system umożliwia selektywne rozszczepienie wiązań C–O, C–N i C–S w identycznych łagodnych warunkach, utrzymując pełną kompatybilność z:

• Boc
• Benzyl
• Grupami chroniącymi fenolowe
• Funkcjonalnościami estrowymi

Reprezentuje to znaczące ulepszenie w porównaniu do tradycyjnej chemii deprotekcji mediowanej przez kwas.

Porównanie z konwencjonalną SPPS opartej na TFA

W porównaniu do standardowych strategii deprotekcji mediowanej przez TFA, system Fmoc/Pic oferuje:

• Łagodne wodne warunki reakcji
• Brak generowania reaktywnych kationów tert-butylowych
• Eliminację reakcji bocznych, takich jak:
  • Tworzenie sulfoniów
  • Nieodwracalna S-alkilacja
  • Modyfikacja łańcuchów bocznych aromatycznych
Tra

Warto podkreślić, że deprotekcja Arg(Pbf) – jeden z najtrudniejszych kroków w SPPS – jest osiągana szybko i czysto w warunkach fotochemicznych bez degradacji szkieletu.

To zapewnia znaczące przewagę dla peptydów zawierających wrażliwe reszty, takie jak cysteina, tyrozyna i tryptofan.

Kompatybilność z żywicą i w pełni zautomatyzowana SPPS z fotorozszczepieniem

Aby w pełni wyeliminować użycie TFA, żywice wrażliwe na kwas, takie jak żywica amidowa Sieber i żywica 2-chlorotritylowa, zostały użyte do syntezy peptydów na końcu C.

Po złożeniu peptydów globalna deprotekcja i rozszczepienie zostały osiągnięte poprzez promieniowanie światłem widzialnym.

Główne osiągnięcia obejmują:

• Efektywną syntezę 9 peptydów z amidem na końcu C (wydajności 52–65% dla peptydów bioaktywnych, takich jak oksytocyna i terlipresyna)
• Doskonałą stabilność sekwencji zawierających metioninę bez dodatków chroniących przed utlenieniem
• Pomyślną syntezę długich i złożonych peptydów (>40 aminokwasów) z wieloma modyfikacjami Pic
• Poprawioną hydrofilowość peptydów i skrócone czasy retencji w HPLC

Warto podkreślić, że trudne peptydy terapeuty